Urodzony został w 1628 roku w Crevalcore, studiował filozofię i medycynę w Bolonii. W wieku 21 lat stracił rodziców. Choć władze uniwersyteckie były przeciwne przyjęciu go na studia w Bolonii, ponieważ nie pochodził z tego miasta, jednak udało mu się w końcu dostać na tamtejszy uniwersytet. Studia ukończył w 1653 roku, po czym został członkiem znamienitego dziewięcoosobowego stowarzyszenia dyskusyjno-badawczego, którego celem były badania nad funkcjonowaniem ludzkiego organizmu. Malphigi poślubił córkę jednego ze swoich nauczycieli i podjął prace na uniwersytecie jako wykładowca logiki. W następnym roku został profesorem medycyny teoretycznej na uniwersytecie w Pizie, gdzie nawiązał przyjaźń z Giovannim Borelim, matematykiem i przyrodoznawcą, który badał prace mięśni. Niestety, Malphigi ściągnął na siebie kłopoty, kiedy zaczął podważać tradycyjnie, nie zmienione od czasów starożytnych, teorie medyczne i musiał opuścić Pizę.